Estudió Derecho y Teología en Salamanca. En 1484 se retiró a la vida privada y se ordenó franciscano en el convento de San Juan de los Reyes de Toledo. En 1492 Isabel la Católica le nombró su confesor y consejero. En 1495, a la muerte del Cardenal Mendoza, es nombrado Arzobispo de Toledo, cargo que se vió obligado a aceptar por fuerza, bajo la autoridad del Papa.

En 1499 acompañó a los Reyes Católicos a Granada, donde intervino activamente en la conversión de los moriscos granadinos. Llevado por su celo, mandó quemar numerosos libros árabes, salvando sólo los de medicina. Su actitud fué una de las causas de la rebelión de las Alpujarras. En 1504, al morir la Reina, es nombrado albacea testamentario. En 1506, cuando muere Felipe el Hermoso, los grandes le nombran regente de Castilla.

A la espera de la vuelta del rey don Fernando de su viaje a Nápoles, gobernó con firmeza e impidió que entraran en España las ideas de Lutero. En 1507 el rey católico recompensó su buen gobierno obteniendo para él el capelo cardenalicio, y le nombró inquisidor general.

Con el apoyo del Rey, y atendiendo al testamento de Isabel la Católica, se planteó la conquista de Africa. Envió la expedición de que realizó la conquista de Mazalquivir en 1505 y participó personalmente la que finalizó con la conquista de Orán en 1509, dirigida por Pedro Navarro. Sucesivas incursiones posteriores dieron lugar a la anexión de Melilla, el Peñón de Vélez de la Gomera y Argel.

Al morir el rey don Fernando el Católico en 1516 es nombrado regente de España en virtud del testamento real. En 1517 se puso en camino para recibir al nuevo Rey, Carlos I, pero murió en Roa, Burgos, a la avanzada edad de 81 años antes de poder entrevistarse con el soberano.

Entre sus grandes contribuciones están la fundación de la Universidad de Alcalá de Henares (1508), una de las más brillantes de Europa en el siglo XVI, la publicación de la primera Biblia Políglota Complutense (1517), y la reforma del estado eclesiástico.

Llevó la organización de las milicias provinciales al mayor grado de perfeccionamiento posible mediante la creación en el último año de su regencia de una milicia activa, la impopular Gente de Ordenanza, lo que motivó disturbios. Dispuso que todas la ciudades, villas y aldeas designasen un número de jóvenes útiles para la guerra que, en caso necesario, debían de acudir a formar unidades de infantería de cada distrito. Los vecinos de cada comarca debían costear y reunir en los puntos señalados las espingardas, picas y coseletes necesarios para armarlos, mientras que la corona proporcionaría el uniforme y la vestimenta. De esta manera el ejército real podría contar con unos 31.800 infantes listos para entrar en campaña.